Armin


	Zweidimensionale Gelelektrophorese zur Isolierug Gattungs-spezifischer repetitiver DNA-Sequenzen Michael Mersmann, Prof. Dr. Armin Hildebrandt

Fragestellung

Können durch Vergleich zweidimensionaler Gel-Auftrennungsmuster von DNA-Restriktionsfragmenten verschiedener Getreidearten, Gattungs-spezifische DNA-Fragmente entdeckt werden, die als DNA-Sonden zur Identifizierung von Getreidearten genutzt werden können ?


	Methode Isolierte Pflanzen-DNA wird mit dem Restriktionsenzym MboI geschnitten und herkömmlich in einem 1,5% Agarose-Gel aufgetrennt. Die so gewonnene Lane wird ausgeschnitten und der Gelstreifen quer zur Laufrichtung an die Obererkante eines 2. Agarose-Gels angelegt. Dieses 2. Gel enthält einen Farbstoff (Bisbenzimid) der vorzugsweise in AT-Clustern der DNA-Helix interkaliert. Dieser Farbstoff wird durch eine kovalent gebundene Polyethylenglycol-Kette (PEG) modifiziert.(1) DNA-Fragmente gleicher Länge werden im 2. Gellauf je nach AT-Gehalt und damit je nach Menge des gebundenen Farbstoff-PEG-Konstruktes verschieden stark bei der Wanderung im elektrischen Feld des Gels behindert (siehe Schema Abb. 1). Nach Ethidiumbromid-Anfärbung (Abb. 2) werden in dem 2D-Muster stärker angefärbte Spots sichtbar. Es handelt sich um repetitive DNA-Fragmente (2). Der Farbstoff ist kommerziell erhältlich (3).

	Ergebnisse I.Vergleich verschiedener Getreide-2D-Muster: In Abb. 2 wird das 2D-Muster der DNA- Restriktionsfragmente von Dinkel und Gerste beispielhaft dargestellt. Die mit Pfeil markierten Spots (S bei Dinkel und B bei Gerste) wurden aus dem Gel ausgestanzt und die darin enthaltenen repetitiven DNA-Fragmente mit QiaEx (QIAGEN) eluiert und zur Verwendung als DNA-Sonden bei den anschließenden Hybridisierungen mit Digoxigenin (Boehringer) markiert. II.Überprüfung der isolierten DNA-Fragmente B und S auf ihre Gattungsspezifität Mit den DNA-Sonden B aus Gerste und S aus Dinkel wurde auf Southern-Blots von Weizen, Gerste, Hafer und Roggen (beispielhaft) hybridisiert. Die Sonde B erlaubt eine Unterscheidung im Hybridisierungsmuster zwischen 3 Getreidekategorien. A: Weizen und Dinkel, B: Gerste und Hafer, C: Roggen (Abb. 3A). Die Sonde S ist spezifisch für Weizen und Dinkel und hybridisiert nicht mit Gerste-, Hafer- oder Roggen-DNA (Abb. 3B). (Weizen und Dinkel gehören der gleichen Gattung Triticum an.) Sie ist also spezifisch für die Gattung Triticum, aber nicht artspezifisch.


	Abb. 1: Schema der zweidimensionalen Agarose-Gelelektrophorese mit AT-Cluster interkalierendem Farbstoff.


	Abb. 2: 2D-Auftrennung der Restriktions-DNA-Fragmente in 1,8% Agarose- gelen mit Bisbenzimid-PEG-Ether; 0.025 O.D./ml; A: 24 µg Dinkel-DNA; B: 20 µg Gersten- DNA; jeweis mit MboI geschnitten; Pfeile zeigen die anschließend als Sonden zur Hybridisierung (siehe Abb. 3) verwendeten DNA-Fragmente, bei Dinkel das Fragment S, bei Gerste das Fragment B.


	Abb. 3A: Hybridisierung der Sonde B aus Gerste auf Southern-Blots verschiedener Getreidearten, je ca. 1 µg, MboI- geschnitten; Hybridisierung bei 40°C; Stringenzwäsche: 0.5 x SSC, 0.1% SDS bei 55°C; Lane 1: Weizen; 2: Dinkel; 3: Gerste; 4: Hafer; 5: Roggen


	Abb. 3B: Hybridisierung der Sonde S aus Dinkel auf Southern-Blots verschiedener Getreidearten, je ca. 1 µg, MboI- geschnitten; Hybridisierung bei 40°C; Stringenzwäsche: 0.1 x SSC, 0.1% SDS bei 55°C; Lane 1: Weizen; 2: Dinkel; 3: Roggen; 4: Hafer; 5: Gerste

Diskussion

Verschiedene Getreidegattungen können anhand des 2D-Musters unterschieden werden. Zur routinemäßigen Identifizierung ist die 2D-Methode jedoch wenig geeignet, da größere DNA-Mengen benötigt werden (etwa 20µg). Geeignet ist die Methode jedoch zum Auffinden Gattungs-spezifischer DNA-Sonden mit deren Hilfe dann an kleinere DNA-Mengen (etwa 1µg) in Dot-Blots eine Identifizierung durchgeführt werden kann. Das Auffinden Gattungs-spezifischer DNA-Spots in den 2D-Mustern kann durch Hybridisierung mit markierter Gesamt DNA anderer Gattungen beschleunigt werden.
Die Sensitivität des Identifikationsnachweises ist deshalb recht gut, da repetitive DNA-Sequenzen genutzt werden. Erstaunlich ist, daß Gattungen Höherer Organismen wie Getreidepflanzen solche Sequenzen in Kilobasengröße enthalten, die relativ nahe verwandte Gattungen nicht besitzen. Im Unterschied zur PCR-Technik ist die Hybridisierung mit großen DNA-Fragmenten weniger störanfällig. Hervorzuheben ist, daß bei dieser Methodik die Kenntnis der Basensequenz keine Voraussetzung ist.

Literatur

1. Müller,W., Hattesohl, I., Schuetz, H.-J., and Meyer, G. (1981). Nucl.Acids Res. 9, 95-118.
2. Kruse, L., Meyer, G., and Hildebrandt, A. (1993). Biochem.Biophys.Acta 1216, 129-133.
3. Hanse Analytik GmbH, Fahrenheitstraße 1 (BITZ), 28359 Bremen, Tel.: 0421-2208196, Fax:0421-2208278.