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	Isolation and characterisation of a hsp70 gene fragment of Tetrahymena thermophila Dr. Carsten Harms, Prof. Dr. Armin Hildebrandt

Abstract
Tetrahymena thermophila, exposed to thermal stress at 34°C, increases the expression of the HSP 70 protein tenfold. Based on the assumption that the selected region from where the primers are constructed is highly conserved, primers from Saccharomyces cerevisiae were used in a PCR profile with micronucleus DNA. The PCR produced a DNA fragment of 183 bp. Both the S. cerevisiae and T. thermophila amplicons had the same length and are located at the same position after the gel run. Further experiments with a PEG tail linked yellow dye resulted in no difference. The T. thermophila amplicons were sequenced and identified as homologous fragments to S. cerevisiae. These results were verified by control PCR experiments with specific S. cerevisiae primers from the 17S rDNA gene. The induction of transcription of the highly conserved heatshock gene of T. thermophila is shown by using the PCR probe. Results obtained by northern blotting show constant increase of mRNA coding for hsp70 gene after three minutes and a maximum after 10 minutes.

Einführung
Bei allen bis jetzt getesteten Lebewesen läuft die Streßreaktion auf molekularer Ebene gleich ab [1,2, 3,4] . Amaral, M. D et al. [5] erkannten, daß die Antwort auf thermalen Streß bei Saccharomyces cerevisiae und Tetrahymena pyriformis auffallend ähnlich ist. So kommt es bei T. thermophila bei einem Temperaturwechsel von 28°C auf 34°C zu einer drastischen Reduktion der normalen Zellproteine, während unter anderem die Expression zweier Hauptgruppen der Hitzeschock- proteine der Größe 70-75 kDa induziert wird. Amaral, M. D et al. stellten ferner fest, daß die Lebenszeit der mRNA mit 10 min. sehr kurz ist. Sie zeigten, daß die Akkumulation der HSP70 Proteine die Expression der hsp70 mRNA bei T. pyriformis negativ reguliert. Der niedrigste Level der mRNA zeigt sich bei der maximalen Konzentration der HSP70 Proteine. Die vorliegende Arbeit stellt nun die Induktion der HSP70 Proteine von Tetrahymena thermophila und die anschließende Isolation eines hsp70 Gen-Fragmentes mit Hilfe der PCR und Primern aus Saccharomyces cerevisiae dar. Ferner wird die Induktion der hsp70 mRNA und deren Persistenz mit nichtradioaktiven Methoden definiert.

Ergebnisse

Charakterisierung hitzeinduzierter Proteine (HSP 70) durch nichtradioaktiver Nachweismethoden
Die Versuche in Fig. 1 sollten die Bedingungen für die Stressinduktion der HSP70 Proteine bei T. thermophila festlegen. Dazu wurden die Zellen, anders als bei [5] mit 36°C, mit 34°C für 15 min. thermal gestreßt. Man erkennt eine deutliche Zunahme der HSP70 Proteine bei den induzierten Zellen (Fig.1; C I-3). Eine konstitutive Expression der HSP70 Proteine ist auch bei einer Erhöhung der Gesamtprotein-konzentration bis 100µg aus physiologisch wachsenden Zellen nach der Westernblot Analyse nicht erkennbar.

PCR Versuche mit heterologen Primern
Für die Untersuchung der Homologie der konservierten Hitzeschock-gene wurden PCR Versuche mit den hsp70 bzw. 17S rDNA Primer durchgeführt. Wie in Fig.2; lane 1 und 3 erkennbar ist, läßt sich mit stringenten Primern aus dem hsp70 Gen ein PCR-Fragment aus T. thermophila DNA amplifizieren, das mit 187bp die gleiche Größe wie das PCR-Kontroll Fragment aus S. cerevisiae besitzt. Für die Überprüfung auf Hefe-Kontamination wurden dann im folgenden mehrere Kontrollen durchgeführt. So ist auf Fig. 2; lane 4 und 6 die PCR mit DNA und den hsp70-bzw. 17S rDNA-Primern (850 bp) aufgetragen worden. Der Unterschied der beiden lanes besteht lediglich in der Auftragskonzentrationen. Da in der lane 5 kein PCR-Fragment amplifiziert wurde läßt sich resümieren, daß eine Kontamination der T. thermophila-DNA sowohl während der Nukleinsäuren-Präparation, als auch bei der PCR-Durchführung, mit Hefe-DNA auszuschließen ist.

Überprüfung der Sequenzunterschiede der PCR- Produkte durch ein 1,5%iges HA-Y Agarosegel [20]
Wie bereits in [13] beschrieben, können mit dieser Methode, die hier in Fig.3 verwendet wurde, PCR-Fragmente mit gleicher Basenanzahl aufgrund ihrer Basenzusammensetzung getrennt werden. Die in Fig.2; lane 1 und 3 amplifizierten Amplikons wurden nach Elution einer Elektrophorese mit dem Farbstoff HA-Y unterzogen. Auch unter diesen Bedingungen wurden die aufgetragenen Fragmente (Fig.3 Abb. C-1 lane 1,2 und 3) nicht voneinander getrennt, während die Trennung der Mixtur bestehend aus Huhn, Ziege und Reh PCR-Fragmenten (Abb.B; lane 1) deutlich erkennbar ist. Daraus lassen sich erste Erkenntnisse bezüglich einer starken Homologie der Basenzusammensetzung der Hefe und T. therrmophila PCR-Fragmente ziehen.

Northernblot Analyse
Die folgenden Northernblot Analysen sollten einerseits die gewonnene homologe T. thermophila hsp70 Sonde überprüfen und andererseits den hsp70 mRNA-Gehalt nach unterschiedlichen Hitzeschockzeiten darstellen. Die nichtradioaktiven Northernblot Analysen ergaben eine Induktionskurve der mRNA mit einer Größe von 2,7kb (Fig.4; Abb.A/B lane 1-4,), die ihr Maximum nach 10 min. thermalen Stresses erreichte. Bereits 5 bzw. 10 min. (lane 5 und 6) später ging der mRNA-Gehalt bereits auf das Niveau der unbehandelten Kontroll mRNA zurück. Die Ergebnisse dieser Analysen führen zum Schluß, daß es sich hierbei um das induzierbare Hitzeschockgen hsp70 von Tetrahymena thermophila handeln muß.

Fig.1: A.1 Auftrag der Gesamtproteine aus exponentiell wachsenden Zellen (nach Coomassiefärbung); B u. C. Westernblot Analyse: 100 (1); 50 (2); 10µg (3) Gesamtproteinkonzentration. B. vor 10 min. Hitzeschock, C. nach 10 min. Hitzeschock mit 34°C.;

Fig.2: PCR-Versuche mit heterologen Primern; 1. T. thermophila DNA mit hsp-Primern; 2. Kontroll-PCR mit H2O und hsp-Primern; 3. S. cerevisiae DNA und hsp-Primern. 4. S. cervisiae-DNA mit hefespezifischen Primern; 5. T. thermophila-DNA mit den Hefe-Primern; 6. gleicher Ansatz wie 4. mit halber DNA- Substratkonzentration; 7. bidest mit Hefe-Primern.

Fig.3: HA-Y Gele; A.1 T. thermophila PCR-Fragment; A.2 S. cervisiae PCR-Fragment; B.1 interner Standard für HA-Y-Gele (von oben nach unten: Huhn-, Ziegen-, Reh-PCR-Fragmente mit Cytochrom b-Primern); C.1 T. thermophila- DNA; C.2 S. cerevisiae-DNA; C.3 T. thermophila / S. cerevisiae-Mixtur nach Auftrennung auf einem 1,8% igen HA-Y-Gel.

Fig.4: Northernblot Analysen; mRNA nach: 0 (1); 3 (2); 5 (3); 10 (4); 15 (5); 20 (6) Minuten Hitzeschock (34°C)

Material und Methoden

Chemikalien
Trypton und Pepton wurde von Gibco, Felll-EDTA von Sigma bezogen. Alle Detektionsreagenzien (ELISA, Nichtradioaktive Hybridisierungsreagenzien) erhielten wir von Boehringer Mannheim bzw. Promega. Die Primer wurden von MWG bezogen.
Zellkultivierung und Stressinduktion
1 Liter Medium nach [ 6 ] wurde autoklaviert und Tetrahymena thermophila Zellen (Stamm 5) bis zu einer Dichte von 1-2x10' wachsen gelassen. Die sich in der log-Phase befindlichen Zellen wurden aliquotiert und bei 34°C mit unterschiedlichen Zeiten hitzeinduziert (siehe Northernblot-Legende).
Gesamtprotein-Extraktion und PAGE
T. thermophila Zellen wurden 5min. mit 8000xg zentrifugiert und das Pellet in 500µl Lysispuffer wie in [7] beschrieben lysiert. Der Überstand wurde verworfen und 10, 50 und 100µl Proteinlysat vor dem Beladen auf ein Polyacrylamidgel [8] drei Minuten in Probenpuffer [9] durch Kochen denaturiert.
Westernblot Analyse und Detektion
Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in Transferpuffer [9] bei 200 V in 90 min. mittels einer Elektrodenkammer auf Nitrocellulose (Hybond C-extra, Amersham) transferiert. Nach dem Transfer wurde die Nitrocellulose nach dem Protokoll der Firma Promega behandelt und mit dem humanen monoklonalen Antikörper der Firma Dianova inkubiert.


	Diskussion Diese Arbeit zeigt im ersten Teil die Erhöhung des Gehaltes der HSP70 Proteine . Zu sehen sind auf Fig.1 (Abb.C lane 5, 6 und 7) drei Banden nach dem Immunoblotten und dem Immunostaining mit dem humanen monoklonalen Antikörper nach Hitzeschock. Hierbei handelt es vermutlich um Isoformen des gleichen HSP70 Proteins nach Denaturierung mit Natrium dodecyl sulfat [15]. Avides Carmo, M. et al. konstruierten ein Oligonukleotid aus zwei HSE Regionen und führten damit ein Bandshift Assay durch [16]. Auch hier wurde zur Analyse der Promotorregion neben einem Drosophila-HSE ein Hefe-HSE verwendet. Anders als bei dem 33 mer Oligomer von Amaral, M. D. et al., das zur Hybridisierung benutzt wurde, welches aus der Aminosäurensequenz mehrerer Organismen [17] unter Berück-sichtigung der Codon Usage von T. pyriformis konstruiert wurde, wurde in dieser Arbeit absichtlich mit stringenten Primem gearbeitet. Trotz der beobachteten unterschiedlichen Codon usage [18,19] wurden Primer nach Abgleich aus der EMBL-Datenbank aus dem homologen codierenden Bereich des hsp70 Gens von Saccharomyces cerevisiae synthetisiert und direkt in die PCR eingesetzt. Erste Hinweise über die Homolgie der zuvor amplifizierten PCR-Fragmente zeigten dann auch die Versuche mit dem Farbstoff HA-Y. Die Sequenzierung der S. cerevisiae- und T. thermophila-Amplikons ergab dann auch eine 100%ige Homologie. Ein weiterer Schluß läßt sich aus den geschilderten Ergebnissen ziehen. Das Codon-usage, so wie es von Martindale, D. W. beschrieben wurde, trifft zumindest bei dem untersuchten Hitzeschockgen hsp70 von T. thermophila und im Vergleich S. cerevisiae nicht zu. Die (in Fig. 4 lane 1, 5 und 6) abgebildeten Northernblot Analysen bestätigen die bereits von Amaral, M. D. et al. bei T. pyrifomis gemachten Beobachtungen, daß die mRNA für das hsp70 Gen nur in hitzeinduzierten präsent ist, nicht aber in physiologisch wachsenden Zellen. Dieses Phänomen läßt sich mit den bereits von Amaral, M. D. erzielten Ergebnissen erklären. Demnach scheinen auch bei T. thermophila die induzierten HSP70 Proteine einer negativen Feedback-Regulation zu unterliegen. Sämtliche bisherigen Versuche, die sich auf die Analyse beziehungsweise Untersuchung des hsp70 Gens bei T. thermophila oder T. pyriformis beziehen, wurden mit heterologen Sonden durchgeführt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß es für die Untersuchung und Isolation des hsp70 Gens keinerlei Modifikation der DNA-Sonden bedarf.

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Mikrokernisolation und DNA-Präparation
Die Mikrokerne wurden nach [10] isoliert und 400µl Guanidium-Isothiocyanat-Puffer (4 M Guanidium-Isothiocyanat; 100mM Tris-HCI, pH 7,5) für 10min. bei RT lysiert. Das Lysat wurde dann in 2ml Applikationspuffer [11] aufgenommen und 15min. bei RT inkubiert. Die Lösung wurde anschließend zweimal mit ssPhenol und Chloroform ausgeschüttelt und die Mikrokern-DNA nach Maniatis et al. ausgeschüttelt.
PCR-Versuche
100 ng T. thermophila und S. cerevisiae DNA wurden in einem PCR-Versuch nach [12] eingesetzt und die Annealing Temperatur auf 48°C für 1 min. eingestellt. Die Primer (hsp01 tgt caa aag ctg tcg; hsp02 ttc gaa gga ttc ata) wurden aus dem hochkonservierten Bereich des hsp70 Gens von S. cerevisiae gewählt. Für die Kontrollen wurden Primer aus dem 17S rDNA Gen verwendet, die allein spezifisch für dieses Gen sind. Wurden die Amplikons als Sonde verwendet, so wurde zu der PCR-Reaktion dig 11-dUTP in einer Konzentration von 0,2µM addiert. Die Amplikons wurden dann aus dem Gel eluiert und direkt in den Hybridisierungsversuche eingesetzt.
Auftrennung der Amplikons auf einem 1,5%igen HA -Y [13] Agarosegel
20µl eines 100µl PCR-Ansatzes wurden auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen, dem der gelbe Farbstoff HA-Y mit einer OD von 0,017 nach Abkühlung des Gels auf 60°C dazugegeben wurde. Der Gellauf wurde mit 50V für 3,5 Std. durchgeführt.
Nichtradioaktive Northemblot Analyse
Für die Northemblot Versuche wurde die poly A+ angereicherte RNA von hitzeinduzierten und Kontroll- Zellen (wie in [9] beschrieben isoliert), auf einem formaldehydhaltigen (2,2M) 1,5% igen Agarosegel getrennt und auf Nylon geblottet. Anschließend mit 0,25Kj/cm2 immobilisiert und in 10 ml Hybridisierungslösung modifiziert nach [14] [5xP-Puffer (1%BSA Frak. 5; l% Polyvinylpyrolidon, l% Ficoll, 250 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,5% Na-pyrophosphat; 5%SDS); 10 % Dextransulfat; 50 % deionisiertes Formnamid; 1 M NaCl; 100ng/ml ultageschallte Kalbsthymus-DNA] 18Std. bei 42°C prähybridisiert. Die oben beschriebene Amplikon-Sonde wurde zu 5ml frischer Hybridisierungslösung mit einer Konzentration von 50ng/ml gegeben und die Filter 48 Std. bei 39°C hybridisiert.
Nichtradioaktiver Nachweis der Northernblots
Die Filter wurden 2 mal in 50ml 2xSSC; 0, 1% SDS für 15min. bei RT und 2 mal mit 50ml 0,5x SSC; 0,1%SDS bei 58°C gewaschen und anschließend wie im Manual der Firma Boehringer beschrieben behandelt.