PAK


	IDENTIFIZIERUNG PAK (POLYCYKLISCHE AROMATISCHE KOHLENWASSERSTOFFE) ABBAUENDER BODENBAKTERIEN MITTELS GENTECHNISCHER NACHWEISMETHODEN Dr. Christian Hamann, Prof. Dr. Armin Hildebrandt


	Ausgangssituation:

	Bakterienmischpopulation in unkontaminierten Böden: geringe Häufigkeit PAK-abbauspezifischer Gene (o)


	Bakterienpopulation in PAK-kontaminierten Böden: erhöhte Häufigkeit PAK-abbauspezifischer Gene (o)


	Problem: Wie können PAK-abbauende Bakterien identifiziert werden ?


	Strategie: Nachweis eines PAK-abbauspezifischen Gens (xyl E) in PAK-adaptierten Bodenmischpopulationen. Dieser Nachweis kann geführt werden durch:


	I.)


	Semiquantitativen Nachweis von xylE in Gesamt-DNA-Extrakten aus Bodenproben mit markierter xylE Sonde (Chemilumineszenz) ohne voherige Anzucht der Bakterien:



		Markierung der DNA (je 2µg) aus verschiedenen PAK-abbauenden Mischkulturen und einer nicht-adaptierten Kultur mit der angefärbten xyl E-Sonde (Dot-Blot-Hybridisierung): Dot 1 - 5: 5 PAK-adaptierte Mischkulturen; Dot 6: nicht-adaptierte Mischkultur aus Gartenerde


	Folgerung: - Korrelation der Markierungsintensität mit dem PAK-Abbaupotential - Detektion PAK-abbauspezifischer Gene auch nicht-kultivierbarer Bakterien möglich


	II.)


	Nachweis vereinzelter xylE-haltiger Bakterienkolonien mit markierter xyl E-Sonde (Chemilumineszenz) nach Ausplattieren und nicht-selektiver Anzucht auf Vollmedium:



		Markierung von PAK-abbauenden Kolonien aus Mischkulturen und einer nicht-adaptierten Kultur mit der angefärbten xylE-Sonde (Kolonie-Hybridisierung: Anfärbung des Abklatschpräparates einer bakterien- bewachsenen Agarplatte mittels Gensonde); oben: Photo der Kulturplatte; unten: Chemilumineszenznachweis xyl E-markierter Kolonien. 1 und 2: PAK-adaptierte Mischkulturen ; 3: nicht adaptierte Mischkultur aus Gartenerde


	Folgerung: - Korrelation der Anzahl markierter Kolonien mit dem PAK-Abbaupotential der Mischkultur - keine zeitaufwendige Anzucht auf Selektivmedien erforderlich - nur lebensfähige und zum Wachstum auf Vollmedium befähigte Bakterien werden detektiert


	III.)


	Für den Nachweis weiterer PAK-abbauspezifischer Gene (Aromatendioxygenasen) in Reinkulturen konnte außerdem die PCR-Technik erfolgreich etabliert werden.


	Durch das Verfahren der PCR-Technik lassen sich in der DNA von PAK-abbauenden Reinkulturen PAK- abbauspezifische Gene (Aromatendioxygenasen) qualitativ darstellen.

		Gel einer PCR (Ethidiumbromid-Färbung) mit Aromatendioxygenase-spezifischen Primern: #1: DNA-Molekulargewichtsmarker(pBR AluI) #2-5: diverse PAK-abbauende Reinkulturen #6: Negativ-Kontrolle (E. coli)


	Detektion ndoB-homologer Gene in verschiedenen PAK-abbauenden Reinkulturen durch Southern-Blot- Hybridisierungen.


	Gel verschiedener Restriktionsansätze mit DNA von PAK-abbauenden Reinkulturen: #1: DNA-Molekulargewichtsmarker ( Hind III) #2-7: diverse PAK-abbauende Reinkulturen #8: DNA-Molekulargewichtsmarker ( Hind III)


	Southern-Hybridisierung der PAK-abbauenden Reinkulturen mit ndoB-spezifischer DNA-Sonde (Chemolumineszenznachweis)

Schlußfolgerung:

Die dargestellten Methoden der Gensonden- und PCR-Technik ermöglichen eine aussagekräftige Dar- stellung des PAK- Abbaupotentials von Bakterienpopulationen und damit eine verbesserte Prozesskontrolle in biologischen Dekontaminations- verfahren (Monitoring der Populationsentwicklung; gezieltes Erstellen von schadstoffspezifischen Animpfkulturen und Verfolgung des Schicksals entsprechender Kulturen während des Sanierungsprozesses).